Prokaria (Matís)
www.matis.is

Dr. Guðmundur Ó. Hreggviðsson stýrir verkþáttum Matís í verkefninu Lífeldsneyti - hér
Dr. Ólafur Friðjónsson (ráðgjöf), Dr. Bryndís Björnsdóttir (erfðatækni) og Sólveig Ólafsdóttir (tæknim.).

Ábyrgðarsvið Prókaría í verkefninu Lífeldsneyti er einkum í verkþætti 4.1 og 4.2

  • Verkþáttur 4.1. Líf-Etanól (BioEthano)
  • 4.1.1. Skimun á hitakærum etanólframleiðandi stofnum ( „Strain screening program“ ) - lokið 
  • 4.1.2. Greining á afurðum gerjunar eftir vöxt á mismunandi sykrum - lokið
  • 4.1.3. Raðgreining á erfðamengi (Matís) valinna stofna (UNAK) - lokið
  • 4.1.4. Hönnun og smíði gena - úrfellingar/innsetningar eininga.
  • Verkþáttur 4.2. Líf-Vetni (Biohydrogen) og Líf-metan (Biomethane).)
  • 4.2.1. Líf-Vetni
  • 4.2.1.1. Mat á niðurbroti kolvetna og framleiðslugeta hitakærra bakteria - lokið
  • 4.2.1.2. Könnun á hvarfefnabreydd (nýtingu kolefnis) fjögurra stofna - lokið
  • 4.2.1.3. Áhrif þrýstings og efnastyrks á vöxt baktería - lokið
  • 4.2.2. Líf-Metan
  • 4.2.2.1. Metanframleiðslugeta metanbaktería sem til eru hjá UNAK.

Vörður til að marka framvindu á árinu 2012 sem er síðasta stuðningsár verkefnis Lífeldsneyti:

  • Verkþáttur 4.1. Prokaria (Matís). VARÐA 1. Ný valgen verða fundin fyrir frekari erfðabætur á Thermoanaerobacterium AK17 og ummyndunartilraunum verður lokið á árinu 2010. Markmiðið er að bæði edikssýrumyndun og mjólkursýrumyndun verði slegin út í sama Thermoanaerobacterium AK17 stofni. Innsetning beta-glúkósidasa í Thermoanaerobacterium AK17 verður  vel á veg komin í lok verkefnisins. Lokaskýrslu verður skilað í árslok 2012. Ákveðið var á grundvelllli niðurstaðna úr verkþáttum 4.1.1, 4.1.2 og 4.1.3  að leggja áherslu á erfðabótavinnu við stofninn Thermoanaerobacterium AK17. Hann er öflugastur etanólframleiðandi af þeim bakteríum sem rannsakaðar hafa verið og fyrirliggjandi eru stökkbrigði þar sem aukefnaframleiðsla hefur verið slegin út (lactate – og acetate-). Framhaldsvinna á þriðja verkefnisári mun felast í því að koma þessum stökkbrigðum fyrir í einum og sama stofni og vinna er einnig hafin við að koma beta-glúkósidasa geni inn í Thermoanaerobacterium AK17. Þetta gen kóðar fyrir ensím sem brýtur niður selló-bíósa og aðrar sellófásykrur og gerir hann öflugri nýtanda niðurbrotsafurða sellulósa.

    Verkþáttur 4.1.4. Thermoanaerobacterium AK17 var metinn sem besti kosturinn til etanól-framleiðslu í undanfarandi verkþáttum. Fyrirliggjandi eru stökkbrigði þar sem aukaefnisframleiðsla hefur verið slegin út, annars vegar mjólkursýra (lactate-) og hins vegar edikssýra (acetate-) í sitthvorum stofninum . Reynt verður að sameina þessar stökkbreytingar í einum og sama stofni með þar tilgerðum úrfellingarkassettum. Finna þarf ný valgen en ónæmisgen fyrir sýklalyfið kanamycin var notað fyrir fyrri útfellingar. Því þarf að finna ný og nýta önnur valgen. Slík gen myndu gera stofninn ónæman fyrir öðrum sýklalyfjum. Smíðaðar verða úrfellingarkassettur með þessum valgenum og ummyndunartilraunir gerðar. Áætlað er að þessari vinnu ljúki um mitt þriðja ár (2012). Í lok ársins er áætlað að Thermoanaerobacterium AK17 stofn hafi verið smíðaður með þessum úrfellingarkassettum þar sem bæði mjólkursýru og edikssýru hefur verið slegin út. Þess er vænst að með þessu mót muni etanól framleiðsla aukast í stofninum. Þessar kassettur verð einnig notaðar til að koma nýju geni inn í stofninn, sem kóðar fyrir beta-glúkósidasa.

„Breytingar á áætlun“ : Ákveðið var að binda rannsóknir á  lokaári verkefnisins ( 2012) við endurbætur á besta stofninum úr skimunartilraunum og vaxtarathugunum, Thermoanaerobacterium AK17. Minni fjármögnun fram að þessu miðað við upphaflega áætlun hefur augljóslega takmarkað það sem hægt er að gera. Viðbótarframlag hefur fengist til frekari verka frá orkusjóði til þessa að koma inn beta-glúkósidasageninu og það eflir von um góðan árangur. Samkvæmt markmiði þessa verkþáttar á að fá fram öflugri etanólframleiðenda með erfðabótum og  þetta vænlegasta leiðin til að ná því markmiði og  því engin breyting á áætlaðri lokaafurð verkþáttarins.

  • Verkþáttur 4.2. Prokaria (Matís). Í undirverkþætti 4.2.2.1.  (Characterization of methanogens in the culture collection of UA) er búið að kanna metanframleiðslugetu þeirra metanstofna sem til eru í stofnasafni UNAK . Ekki hefur enn tekist að klára að raðgreina 16S rRNA til að fá skyldleika þessara stofna en það verður gert með samvinnu við Prokaria. Þetta hefur ekki enn tekist en verður framkvæmt á fyrstu sex mánuðum þriðja verkefnaárs. Mun erfiðara hefur reynst að raðgreina metanstofna samanborið við aðrar bakteríur en metanstofnar eru fyrnur (archaea) og því þarf aðra aðferðfræði samanborið við venjulegar bakteríur (bacteria).

Úr áfangaskýrslu 2011:

I. Framvinda verkefnis á árinu 2011

Verkþáttur 4.1. Líf-Etanól / BioEthanol

Þrír stofnar af hitakærum etanólframleiðandi örverum voru valdir á grunni vinnu í verkpakka 4.1 og 4.2. Raðgreining á erfðamengi þeirra stendur nú yfir. Lífupplýsingafræðileg greining á erfðamengi þeirra fer fram í verkþætti 4.3. á öðru ári verkefnisins. Hún felur í sér greiningu á staðsetningu gena og hlutverki mögulegra genaafurða, samkvæmt samanburði við önnur erfðamengi og prótein (annotation). Borin verður kennsl á gen sem koma við sögu í efnaskiptum gerjunar. Þar með verður unnt að skilgreina efnskiptarásir og ensím sem koma við sögu við ethanól myndun.

Þá verður hafist handa við erfðaverkfræði þessara stofna í verkhluta 4.3., þar sem markmiðið er að beina kolefnisflaumi yfir í etanólmyndun. Hannaðar og smíðaðar verða erfðaefniseiningar (modules) fyrir erfðabreytingar á viðkomandi stofnum. Annars vegar fyrir úrfellingar á genum ensíma sem leiða til myndunar óæskilegra aukaafurða. Hins vegar fyrir innsetningar á genum ensíma sem stuðla að aukinni ethanól myndun, beint eða óbeint. Um leið verður geta til ummyndunar (erfðabreytinga) rannsökuð. Slíkar erfðaefniseiningar (deletion-, insertion-modules) eiga að liggja fyrir í lok annars verkefnaárs þannig að unnt verði að hefja ummyndun (erfðabreytingar) í nýja etanólframleiðslu stofna í upphafi 3. verkefnisárs.

Verkþáttur 4.1.1  „Strain screening program“ lauk á fyrst ári verkefnisins. Nokkrir nýir stofnar sem uxu við 70°C voru einangraðir og tilheyrðu þeir ættkvíslunum Fervidobacterium, Thermoanaerobacter, Caloramator og Thermoterraabacterium. Allir uxu vel á glúkosa. 15 stofnar voru valdir úr til nánari athugunar. ÞeiUMr voru rannsakaðir með tilliti til vaxtar á mismunandi kolefnisgjöfum öðrum en glúkósa. Allir sýndu mikla hvarfefnisbreidd og uxu á mismunandi pentósa og hexósa sykrum. Að minnsta kosti. þrír þeirra uxu á cellulosa (CMC) og á pappír. Afurðir gerjunar voru greindar eftir vöxt á glúkósa, xylósa, arabínósa og mannósa.

Verkþáttur 4.1.2  „Physiology of growth and ethanol and hydrogen production“ lauk um miðbik annars árs. Flestir stofnarnir framleiddu etanól en í mismiklu magni. Ennfremur framleiddu stofnarnir mismikið af mjólkursýru, ediksýru, glyseróli og sumir óþekktar gerjunarafurðir sem þyrfti að efnagreina.. Ræktunartilraunir og ætisþróun hefur farið fram á fáum völdum stofnum. Vaxtarsýrustigs og -hitastigsbil hefur verið skilgreint fyrir skilvirkasta sellulósa-sundrandi stofninn. Viðmiðunarstofninn Thermoanaerobacterium AK17 var lang bestur allra stofnar sem kannaður voru, en þrír nýir stofnar þóttu einnig álitlegir etanólframleiðslustofnar þar á meðal einn Calaromator stofn.

Verkþáttur 4.1.3 „Genomic sequence analysis“ er lokið. Stöðuskýrslur liggja fyrir. Niðurstöður verkþáttar 4.1.2. leiddu til vals á Calaromator stofni sem var heilraðgreindur og gen gerjunarferilsins voru auðkennd. Þar með var hægt að hefja vinnu 4.1.4 Design and construction of deletion/insertion modules (hönnun og smíði úrfellingar/innsetningar eininga). Ennfremur var bætt við raðgreiningum á viðmiðunarstofninum Thermoanaerobacterium AK17 sem er öflugur etanólframleiðslustofn. Í fyrra rannsóknarverkefni sem styrkt var af Rannís (Bioethanol) var genamengi stofnsins raðgreint en einungis með lágri þekju (coverage). Því var ekki hægt að framkvæma nákvæma kerfislíffræðilega greiningu á erfðamengi stofnsins. Í þessu verkefni var bætt við raðgreiningum þannig að þekkja er nú 26föld og upplýsingar um erfðamengið liggja fyrir í 120 samfelldum röðum. Því var unnt að framkvæma nákvæmari greiningar á erfðamenginu.

Samkvæmt samningi á neðangreindur afrakstur að vera fyrir hendi og viðkomandi vörðum að vera náð við skil á áfangaskýrslu.
• Afrakstur 4: Niðurstöður úr 4.1.1. og 4.1.2 Skimunartilraunir (4.1.1) og vaxtartilraunir (4.1.2I) á etanólframleiðandi bakteríum liggur fyrir. Lokaskýrsla er tilbúin (sjá Fylgiskjal 1; Isolation of novel anaerobic thermophiles and analyses of their fermentation products). Viðkomandi vörðu er náð.
• Afrakstur 5: Niðurstöður á greiningu á erfðamengi eins stofns (4.1.3) og erfðaefniseiningar fyrir úrfellingar- og innsetningstilraunir. Lokaskýrsla tilbúin (sjá Fylgiskjal 2; Genome sequencing of a fermenting thermophile: strain MAT2989). Viðkomandi vörðu er náð.

Sjá skýrskur frá Matís/Prokaria í tengslum við verkefnið Lífeldsneyti: